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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ CENTRO POLITÉCNICO SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

Expressão gênica diferencial em ostras Crassostrea gigas expostas a esgoto doméstico

IGOR DIAS MEDEIROS

Curitiba – 2008

i

IGOR DIAS MEDEIROS

EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM OSTRAS Crassostrea gigas EXPOSTAS A ESGOTO DOMÉSTICO

Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia Celular e Molecular, Departamento de Biologia Celular, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Biologia Celular e Molecular.

Orientador: Afonso Celso Dias Bainy, Dr.

CURITIBA 2008

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À Simone, Natan e Matias, pra sempre galera!

iii

Agradecimentos

Gostaria de agradecer a todas as pessoas que contribuíram para a realização desse trabalho, em especial:

- ao Afonso, pela oportunidade, amizade e confiança depositada em mais essa parceria. Muito obrigado pela orientação, mas principalmente, pelo exemplo! - aos colegas de projeto, que tornaram possível a realização de cada uma das etapas desta tese: Guilherme, Marília, Dani, Juliano, Fabrício, Nina e Thiago; - ao demais companheiros do lab, em especial à Isabel, Juliana e Taíse, pela iniciação em biomol, e também à Riso, Jacó, Karin, Ana Paula, Talita, Daniela, por estarem sempre presentes. Aqui entra também o Alcir, Jeff e Trevisan, afinal é um grupo só; - ao pessoal do LMM, em especial ao Jaime, Cláudio e ao Jackson, pelo fornecimento das ostras e todo o suporte nos experimentos de exposição em aquários; - à Escola do Mar do município de São José, SC, pelo suporte nos experimentos de campo; - à CASAN, pelo apoio na coleta e análise do esgoto, em especial ao Jairzinho, Vanessa, Terezinha e Edmar; - ao Lab de QMC do IO-USP, Sílvio, Márcia, Satie e Rosalinda, pelas análises químicas; - ao prof. Milton Ozório Moraes da FIOCRUZ, pela ajuda com o seqüenciamento das amostras; - aos professores, colegas e funcionários da pgbiocel, em especial profa. Carolina e prof. Ciro, à Marlene e entre os colegas a Ana, Grazy, Henrique, Rodrigo, Ticyana, Samanta, Fabíola, Alberto e Marcus. Abração especial pro João Gabriel e pro Ciro Criminácio, esse é parceiro!!! - ao pessoal do IBMP por todo o apoio, dedicação e convivência durante os cursos de Biomol e de Genômica. Certamente não lembrarei de todos os nomes, mas sintam-se agradecidos. Em especial vai meu abraço ao Stênio, ao Marco e a Didi, vocês são sensacionais; - ao CNPq pelos projetos que deram suporte a essa tese;

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- aos professores que compõem a banca, que se dispuseram a avaliar esse trabalho bem como a apresentação, obrigado pelas sugestões e críticas, Helena, Carolina, Stênio, Ciro e Pessati, muito obrigado; - à Cristina, ao Ciro (de novo) e ao Adriano, pela hospedagem durante as disciplinas; - a toda galera do grupo Roda Livre, pelas rodas de capoeira na Vila Verde, em especial ao Mestrando Mineiro e ao instrutor Dênis, pé dentro pé fora... - à Ingrid e demais colegas que seguraram legal as minhas aulas em Floripa e Tubarão durante as disciplinas obrigatórias em Curitiba; - a minha grande família Salles, pelo suporte e auxílio durante esse período; - a meu pai, minha mãe e meus irmãos, por me permitirem chegar até aqui com condições de definir;

- à BR 101, pelos momentos de reflexão;

- a minha parceira Simone, que segurou legal a onda em Floripa várias vezes, com duas crianças e sem carro para que eu ficasse de bacana estudando em Curitiba, e aos meus filhos Natan e Matias, para quem eu dedico todo esse trabalho realizado, sem vocês teria sido muito mais difícil! Eu amo vocês três e espero que sejam tão felizes quanto eu sou por estar ao seu lado, obrigado!

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Sumário

Pg. _______________________________________________________________ Lista de Figuras.................................................................................................viii Lista de Tabelas..................................................................................................x Resumo..............................................................................................................xi Abstract..............................................................................................................xii 1

Introdução................................................................................................1

2

Objetivos.................................................................................................10

3

Material e Métodos.................................................................................11

3.1

Ostra Crassostrea gigas.........................................................................11

3.2

Exposição ao esgoto doméstico.............................................................11

3.2.1 Coleta e aclimatação das ostras............................................................11 3.2.2 Coleta do esgoto....................................................................................12 3.2.3 Exposição nos aquários.........................................................................13 3.2.4 Exposição a locais contaminados por esgoto doméstico.......................14 3.3

Análises químicas..................................................................................17

3.4

Análises moleculares.............................................................................19

3.4.1 Preparo da amostra...............................................................................19 3.4.2 Identificação dos genes diferencialmente expressos............................20 3.4.2.1

Extração RNA total......................................................................20

3.4.2.2

Purificação do RNA mensageiro.................................................21

3.4.2.3

Hibridização subtrativa supressiva..............................................21

3.4.2.4

Clonagem dos fragment. de cDNA diferencialm. expressos.....24

3.4.2.5

Purificação do plasmídeo............................................................24

vi

3.4.2.6

Sequenciamento..........................................................................24

3.4.2.7

Análise das sequências...............................................................25

3.4.3 Análise dos genes diferencialmente expressos na exposição ao esgoto em aquários......................................................................................................25 3.4.3.1

Extração do RNA total das brânquias de ostras..........................25

3.4.3.2

Síntese de cDNA das brânquias de ostras..................................25

3.4.3.3

Desenho dos iniciadores de DNA................................................25

3.4.3.4

Padronização das condições de PCR.........................................27

3.4.3.5

Análise da expressão gênica RT-PCR semi-quantitativo...........28

3.4.3.6

Eletroforese em gel de agarose..................................................29

3.4.3.7

Densitometria..............................................................................29

3.4.4 Análise dos genes diferencialmente expressos na exposição ao esgoto no ambiente......................................................................................................29 3.4.5 Análise Estatística dos dados................................................................29 4

Resultados.............................................................................................31

4.1

Índice de Condição das ostras..............................................................31

4.2

Análise do esgoto..................................................................................32

4.3

Fatores Abióticos e Análises Químicas.................................................32

4.4

Identificação dos genes diferencialmente expressos............................35

4.5

(Video) Biologia: Ferramentas online no ensino de Biologia Celular

Análise da expressão gênica diferencial em aquários..........................39

4.6

Análise da expressão gênica diferencial in situ.....................................42

5

Discussão..............................................................................................48

5.1

Fatores Abióticos e Análises Químicas.................................................48

5.2

Análise da expressão gênica diferencial...............................................55

6

Conclusões............................................................................................68

7

Referências Bibliográficas ....................................................................69

8

Anexos..................................................................................................80

vii

8.1 Anexo I: Medeiros, I.D.; Siebert, M.N.; ToledoSilva, G.; Moraes, M.O.; Marques, M.R.F & Bainy, A.C.D. “Differential gene expression in oyster exposed to sewage”. Marine environmental Research – doi: 10.1016/j.marenvres.2008.02.048..............................................................80 8.2 Anexo II: Medeiros, I.D.; Siebert, M.N.; ToledoSilva, G.; Rodrigues, T.B.; Marques, M.R.F & Bainy, A.C.D. “Induced gene expression in oyster Crassostrea gigas exposed to sewage”. Environmental Toxicology and Pharmacolagy - doi:10.1016/j.etap.2008.05.004......................86 8.3 Anexo III: Toledo-Silva, G.; Siebert, M.N.; Medeiros, I.D.; Sincero, T.C.M.; Moraes, M.O.; Goldstone,J.V. & Bainy, A.C.D. “Cloning a new cytochrome P450 isoform (CYP356A1) from oyster Crassostrea gigas”. Marine environmental Research - doi: 10.1016/j.marenvres.2008.02.010....................90 8.4 Anexo IV: Zanette, J.; Nunes, F.F.; Medeiros, I.D.; Siebert, M.N.; Matos, J.J.; Lüchmann, K.H.; Melo, C.M.R. & Bainy, A.C.D. “Comparison of the antioxidant defense system in Crassostrea rhizophorae and Crassostrea gigas exposed to domestic sewage discharges”. Marine environmental Research doi: 0.1016/j.marenvres.2008.02.057................................................................99 8.5 Anexo V: Dafré, A.L.; Medeiros, I.D.; Müller, I.C.; Ventura, E.C. & Bainy, A.C.D. “Antioxidant enzymes and thiol/disulfide status in the digestive gland of the brown mussel Perna perna exposed to lead and paraquat”. ChemicoBiological Interactions 149, 97 – 105. 2004.....................................................107

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: coleta do esgoto doméstico não tratado pelos técnicos em saneamento da Companhia Catarinense de Água e Saneamento..................13 Figura 2: exposição das ostras Crassostrea gigas a 33% de esgoto doméstico não tratado por 48h em aquários.......................................................................14 Figura 3: estrutura flutuante de PVC para exposição das ostras aos locais contaminados por esgoto doméstico.................................................................15 Figura 4: vista parcial da Baía Norte da Ilha de Santa Catarina com os locais de exposição do experimento in situ.................................................................17 Figura 5: ostra Crassostrea gigas com destaque para glândula digestiva, gônadas, manto e brânquias.............................................................................20 Figura 6: esquema ilustrativo da hibridização subtrativa supressiva...............23 Figura 7: índice de condição das ostras utilizadas nos experimentos de exposição ao esgoto..........................................................................................31 Figura 8: parâmetros físicos, químicos e microbiológicos da água dos locais 1, 2, 3 e 4 durante a exposição in situ...................................................................33 Figura 9: produtos de PCR da hibridização subtrativa supressiva em gel de agarose 2% TAE1x............................................................................................36 Figura 10: placa de Petri com as colônias de células JM109 (Promega) contendo os clones resultantes da hibridização subtrativa supressiva............37 Figura 11: padronização do número de ciclos das reações de RT-PCR para análise da expressão gênica em brânquias de ostras expostas a esgoto em aquários.............................................................................................................40 Figura 12: expressão dos genes CYP356A1, GSTO, MDR, FABP e ALAS em ostras expostas a 33% de esgoto doméstico não tratado por 48h....................41 Figura 13: padronização do número de ciclos das reações de RT-PCR em brânquias de ostras expostas a esgoto in situ...................................................43 Figura 14: expressão dos genes CYP356A1, GSTO, MDR, FABP e ALAS em brânquias de ostras expostas a locais contaminados por esgoto por 14 dias..44 Figura 15: padronização do número de ciclos das reações de RT-PCR em glândula digestiva de ostras expostas a esgoto in situ......................................46

ix

Figura 16: expressão dos genes CYP356A1, GSTO, MDR, FABP e ALAS em glândula digestiva de ostras expostas a locais contaminados por esgoto por 14 dias....................................................................................................................47

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: pares de iniciadores e tamanho esperado dos fragmentos gênicos analisados em brânquias de ostras expostas a esgoto.....................................27 Tabela 2: condições das reações de PCR para análise da expressão gênica em brânquias de ostras expostas a esgoto.......................................................28 Tabela 3: parâmetros químicos e microbiológicos do esgoto doméstico não tratado...............................................................................................................32 Tabela 4: concentração de contaminantes orgânicos nas amostras de sedimento dos locais de exposição do experimento in situ..............................34 Tabela 5: concentração dos contaminantes orgânicos nas ostras Crassostrea gigas mantidas nos locais de exposição durante o experimento in situ..........35 Tabela 6: lista dos genes que tiveram sua expressão induzida pela exposição ao esgoto, identificados pela hibridização subtrativa supressiva......................38

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RESUMO

O lançamento de esgoto doméstico em águas superficiais é a principal causa de poluição dos ecossistemas aquáticos ao redor do mundo. O esgoto contém contaminantes diversos como produtos de higiene pessoal, limpeza doméstica, medicamentos humanos e veterinários, óleos e graxas, químicos diversos, além de microorganismos patogênicos e nutrientes em excesso. O contato destes compostos com a biota provoca alterações causando dano e ativando os mecanismos de defesa. A análise da expressão de diferentes genes simultaneamente em um organismo exposto à presença de um contaminante pode auxiliar o entendimento dos mecanismos de toxicidade e defesa biológica, além de contribuir como biomarcador de contaminação em programas de monitoramento ambiental. No presente trabalho, após um período de 10 dias de aclimatação, ostras adultas da espécie Crassostrea gigas (n=10) foram expostas a 33% de esgoto doméstico não tratado por 48h, em aquários de 45L sob condições controladas. Através da técnica de hibridização subtrativa supressiva a expressão diferencial de genes em pool de brânquias de cinco ostras macho foi investigada, sendo obtidos inicialmente 61 clones, dos quais 15 foram identificados. Cinco genes associados a mecanismos de biotransformação de xenobióticos foram escolhidos para confirmação da indução da expressão por RT-PCR semi-quantitativo, normalizado pela expressão do gene da Actina. Esses genes são responsáveis por reações de biotransformação de fase I (CYP356A1), fase II (GSTO), fase III (MDR), transporte de ácidos graxos e compostos hidrofóbicos (FABP) e síntese do grupo heme (ALAS). Todos os genes apresentaram maiores valores de expressão (1,9, 3,3, 3,3, 43,6 e 2,9x para CYP356A1, GSTO, MDR, FABP e ALAS, respectivamente) nas ostras expostas ao esgoto quando comparadas ao grupo controle. Para verificar a aplicabilidade da análise em programas de biomonitoramento in situ, as ostras foram transplantadas para locais referência e contaminados por esgoto doméstico, assim permanecendo por 14 dias. A análise da expressão gênica em brânquias e glândula digestiva das ostras expostas in situ a esgoto doméstico não apresentou diferenças significativas entre os grupos, provavelmente devido ao período de exposição, considerado muito longo para análises moleculares.

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ABSTRACT

The mais cause of surface waters contamination around the world is untreated sewage delivery. Sewage contains several kinds of contaminants like personal care and house cleanning products, human and pet medicines, oils and other chemicals besides patogenic microorganisms and nutrients in excess. The contact of these contaminants with the organisms may cause harm and activate defense mechanisms. The analysis of several genes in the same time in a contaminant stressed organism may contribute to elucidate toxicity and biological defense mechanisms and be usefull as a biomarker in environmental monitoring programs. In this work, after a 10 days acclimatation period, adult crassostrea gigas oysters (n=5) were exposed to 33% of untreated sewage for 48h, in 45L aquariums under controlled conditions. Differential gene expression in pooled gills of male oysters were investigated through supressive subtractive hibridization. From the sixty-one clones obtained 15 were iddentified. Five genes associated with biotransformation of xenobiotics were submited to semiquantitative RT-PCR normalized with actin to confirm the induction in gene expression by sewage. These genes are responsable for fase I (CYP356A1), fase II (GSTO) and fase III (MDR) of xenobiotics biotransformation, fatty acid and hidrofobic compounds transport (FABP) and the heme group synthesis (ALAS). All the analysed genes showed higher values of gene expression (1,9, 3,3, 3,3, 43,6 and 2,9x for CYP356A1, GSTO, MDR, FABP and ALAS, respectively) in sewage exposed oysters compared to control group oysters. To verify the applicability of this kind of analysis in biomonitoring programs, oysters were transplanted to sewage contaminated and reference sites for 14 days. Gene expression analysis in gills and digestive glands of in situ sewage exposed oysters did not show significative differences between the groups, probably because the exposition period was to long for molecular analysis.

1

1

Introdução

A contaminação dos ecossistemas pode afetar os animais expostos causando efeitos adversos nos tecidos alvo e organismos como um todo, podendo refletir na alteração da estrutura das populações e comunidades (Pina et al., 2007). As alterações decorrentes da exposição aos contaminantes nos organismos a nível molecular, bioquímico, fisiológico, histológico ou celular são denominadas biomarcadores (Huggett et al., 1992). O uso de biomarcadores em programas ambientais apresenta algumas vantagens sobre as análises químicas, pois são técnicas mais baratas, que indicam biodisponibilidade, expressam os efeitos tóxicos, podem auxiliar na elucidação dos mecanismos de toxicidade dos xenobióticos e podem possibilitar a detecção de um problema mais grave enquanto ainda há tempo para reverter uma situação adversa (Walker et al., 2001). As características ideais de um biomarcador são especificidade química e

biológica,

sensibilidade,

clareza

de

interpretação,

tempo curto

de

manifestação e permanência da resposta, associação aos níveis mais elevados de organização biológica e aplicabilidade às condições de campo (Huggett et al., 1992). Além disso, devem permitir a distinção entre a variabilidade natural e o estresse induzido pela contaminação e ter significância toxicológica, ou seja, é desejado que a resposta esteja relacionada ao impacto do contaminante sobre o organismo (Pina et al., 2007). Dentro dessa perspectiva, vários parâmetros têm sido analisados nos diferentes níveis de organização biológica. As análises fisiológicas representam a interface entre a parte toxicológica e a ecológica, formando a base para as alterações do organismo como um todo, que por sua vez irão refletir nas características das populações (Munkittrick e van der Kraak., 1999). Penã e Pocsidio (2007) observaram redução na taxa de alimentação e crescimento do gastrópode Pomacea canniculata após dez dias de exposição a cobre, enquanto Andersen e colaboradores (2006) mostraram que a exposição a longo prazo ao desregulador endócrino etinilestradiol afeta a reprodução de uma espécie de peixe. Ao nível citológico e histológico Castro e colaboradores (2004) encontraram os menores valores de estabilidade lisossomal em

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hemócitos de mexilhões de regiões contaminadas com elementos metálicos. Akaishi e colaboradores (2007) observaram aumento da atividade fagocítica, na capacidade de resistir a patógenos e lesões histopatológicas nas brânquias de mexilhões expostos a esgoto doméstico não tratado por 14 dias. A nível bioquímico um aumento na atividade da enzima Glutationa S-transferase e na quantidade de citocromo P450 foi registrado em mexilhões expostos a diclorofenol (Petushok et al., 2002) e Almeida e colaboradores (2003) detectaram uma redução nos níveis de serotonina e dopamina em mexilhões expostos a chumbo e cádmio. Enquanto as análises bioquímicas historicamente tem sido realizadas através da atividade enzimática ou dos níveis de proteína, o desenvolvimento da biologia molecular criou condições para o surgimento de um novo grupo de biomarcadores, baseados na análise da transcrição de genes relacionados ao estresse, os chamados biomarcadores de expressão gênica (Pina et al., 2007). De um modo geral, a presença de um contaminante atua como um efetor que ativa um sensor ou receptor celular, que por sua vez interage com uma sequência específica de DNA no núcleo promovendo a transcrição de algum gene. O produto da transcrição é o RNA mensageiro (RNAm), que é processado e enviado ao citoplasma para que o ribossomo sintetize a proteína correspondente. A proteína, por sua vez, constitui a base molecular da resposta biológica à presença do efetor (Pina et al., 2007). Assim a expressão gênica representa o primeiro nível de interação entre um agente estressor e o genoma, que, através da síntese de proteínas dirige a resposta do organismo às mudanças externas (Brulle et al., 2008). Embora essa norma possa apresentar algumas variações, a quantidade de proteína sintetizada costuma refletir a quantidade de RNAm, que por sua vez depende da indução da transcrição por um receptor que foi ativado pela presença de um efetor em concentração suficiente. Dessa forma a análise da expressão gênica permite diagnosticar a existência de estresse em uma população e analisar esta resposta ao estresse além de contribuir para a elucidação dos mecanismos de regulação da expressão destes genes em resposta a doenças e estímulos ambientais (Ju et al., 2006; Brulle et al., 2008). Finne e colaboradores (2007) afirmaram que

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através do perfil de expressão gênica pode-se monitorar vários biomarcadores clássicos simultaneamente além de ser possível identificar outros novos. De acordo com Maggioli e colaboradores (2006) um crescente número de estudos tem demonstrado que a expressão diferencial de genes pode ser utilizada na análise toxicológica preditiva, auxiliando na identificação da classe de toxicidade de determinado composto. Essa abordagem toxicogenômica pode ajudar a reduzir custos e acelerar os processos de testes de novas drogas, pois alterações na expressão dos genes mediadas por toxinas podem ser detectadas antes que a química clínica, histopatologia ou observações clínicas possam sugerir um efeito tóxico. As ferramentas genômicas estão sendo empregadas também na análise ecotoxicológica, onde tem por objetivo esclarecer os efeitos moleculares e celulares dos contaminantes através das alterações na expressão gênica dos organismos. Esse ramo da ciência, chamado de ecotoxicogenômica, tem crescido substancialmente nos últimos anos, principalmente devido aos esforços de seqüenciamento do genoma de algumas espécies de peixe como Danio rerio e Oryzias latipes (Hoffmann et al., 2006). A decodificação completa do genoma de vários animais seguida da identificação de todos os transcritos e proteínas correspondentes, deverá proporcionar o entendimento de como a expressão dos genes está relacionada com seu status fisiológico e patológico (Chatterjee-Kishore e Whitley, 2004). O sequenciamento completo do genoma de um organismo permite o conhecimento detalhado de sua biologia e constitui uma poderosa ferramenta de análise para os pesquisadores (Saavedra & Bachère, 2006). Entretanto a genômica dispõe de várias outras abordagens que permitem analisar o comportamento de múltiplos genes em situações específicas. Dentre

as

ferramentas

empregadas

na

análise

genômica

as

hibridizações com oligonucleotídeos ou cDNA – (arrays -micro e macro) são muito utilizadas quando se tem conhecimento do genoma do organismo. Os microarrays são basicamente uma lâmina de vidro de microscopia onde milhares de oligonucleotídeos são impressos em um sistema cartesiano (em forma de grade). DNA ou RNAm de duas diferentes populações de células são marcados com material fluorescente e hibridizados com o DNA impresso na

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lâmina. A imagem dos pontos fluorescentes é então digitalizada para análise quantitativa da fluorescência. Através da análise dos arrays é possível descobrir quais genes foram induzidos ou reprimidos em uma determinada população de células comparada à outra (François et al., 2003). Dessa forma os arrays comparam, por exemplo, a abundância relativa de RNAm hibridizado a certo cDNA de duas amostras em um clone impresso na lâmina (Hsu et al., 2006). A principal vantagem dos arrays é fornecer uma “fotografia” da atividade transcricional de milhares de genes simultaneamente (Francois et al., 2003). Por outro lado um fator que tem limitado sua utilização é a pequena disponibilidade de genomas seqüenciados, principalmente quando não se trata de um organismo modelo. Hoffmann e colaboradores (2006) aplicaram o método para analisar a interferência de desreguladores endócrinos sobre a expressão gênica em peixes e encontraram um grupo de genes sob forte influência, porém com identidade desconhecida. Outro fator limitante é o custo dessa tecnologia, que ainda é alto e normalmente torna as repetições muito caras, reduzindo a quantidade de dados disponíveis (Lettieri et al., 2006). Já nos chamados sistemas abertos (quando não se tem conhecimento prévio do genoma do organismo) as técnicas mais comumente utilizadas são o differential display e a hibridização supressiva subtrativa (Bultelle et al., 2002). A estratégia geral utilizada na técnica de differential display é isolar duas populações de RNAm, sintetizar o cDNA a partir de cada uma delas e analisar o resultado em eletroforese. A partir da comparação direta dos géis, os fragmentos diferencialmente expressos são reamplificados e clonados para estudos posteriores. Liao e Freedman (2002) destacam que as vantagens desta técnica são a pequena quantidade de material inicial, simplicidade e sensibilidade do método, comparação lado a lado de várias amostras e rápida identificação e confirmação dos resultados. Por outro lado essa técnica apresenta muitos resultados falso-positivos, que teriam que ser eliminados aumentando o número de repetições ou complementando o método com alguma forma de hibridização de ácidos nucléicos (Bultelle et al., 2002). A hibridização subtrativa supressiva é caracterizada por amplificar exponencialmente os transcritos diferencialmente expressos em um PCR supressivo, após realizar dupla subtração dos transcritos comuns a duas

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populações de cDNA (Figura 6). Em um primeiro momento duas populações de RNAm são reversamente transcritas a cDNA. Uma das populações de cDNA é denominada driver, enquanto a outra, que se quer investigar, é chamada tester. A amostra tester é subdividida em duas e cada uma delas recebe um oligonucleotídeo adaptador diferente na extremidade 5´. Cada subpopulação do tester é então submetida à hibridização em separado com o driver. Os fragmentos gênicos comuns formarão moléculas híbridas enquanto os fragmentos diferencialmente expressos contendo o adaptador não hibridizam. As duas amostras são então misturadas e uma nova quantidade de cDNA driver é adicionado para uma segunda hibridização, porém sem desnaturação. Nesse momento os fragmentos diferencialmente expressos contendo os diferentes adaptadores hibridizam. O produto desta hibridização é submetido a um PCR supressivo em que apenas os genes presentes na amostra tester são amplificados (Figura 6). Nessa reação de PCR os adaptadores desenvolvidos pela Clontech no kit PCR Select cDNA Subtraction favorecem a amplificação dos

transcritos

diferencialmente

expressos

enquanto

a

amplificação

inespecífica é suprimida. Esse método foi utilizado para identificar genes que possam estar envolvidos na defesa contra microorganismos em camarões (He et al., 2004), tolerância a temperatura em ostras (Huvet et al., 2004), exposição a contaminantes em peixes (Baldwin et al., 2005) e outras situações de estresse em diferentes organismos. He e colaboradores (2004) afirmam que a hibridização subtrativa supressiva é um dos métodos mais poderosos para identificação de genes diferencialmente expressos. Investigando a resposta de hemócitos de camarões à contaminação microbiana eles identificaram 25 genes de relevância imunológica, dos quais cinco, escolhidos para confirmação do resultado, tiveram a indução da expressão confirmada por virtual northern blot e RT-PCR semiquantitativo. Por outro lado, Huvet e colaboradores (2004) obtiveram 376 clones, dos quais apenas 150 apresentaram indução da expressão confirmada por blot, enquanto 226 (60%) foram considerados falso positivos ou genes que não tiveram sua expressão alterada pelo tratamento. Os estudos ecotoxicológicos que avaliam ambientes marinhos e estuarinos muitas vezes utilizam moluscos bivalves como organismos

6

sentinela. Esses animais são sésseis e de fácil manuseio, representando bem o local de amostragem e são filtradores, bioacumulando contaminantes dispersos na água enquanto se alimentam do fitoplâncton. Esse fato aliado à importância econômica do cultivo de bivalves na aqüicultura e a sua importância

na

manutenção

dos

ecossistemas

tem

incentivado

o

desenvolvimento da genômica dos bivalves (Saavedra e Bachere, 2006). A ostra Crassostrea gigas apresenta ampla distribuição geográfica e é a segunda espécie mais cultivada comercialmente ao redor do mundo. No Brasil a ostra C.gigas é a espécie mais cultivada e Santa Catarina é o principal estado produtor de ostras no país com uma produção de 3152,4 ton. em 2006 e 1155,8 ton. em 2007 (http://www.pmf.sc.gov.br/fenaostra). A capital do estado, Florianópolis, é uma cidade turística que fica localizada na Ilha de Santa Catarina, local de prática intensa de aqüicultura e que sedia anualmente a Fenaostra, evento turístico que envolve gastronomia e atividades artísticas e culturais para divulgação da ostreicultura. A exploração do turismo em Florianópolis tem seu ponto máximo na temporada de verão, quando a população da cidade aumenta em quase 100% atingindo a capacidade máxima de acomodação nos hotéis e pousadas da Ilha (http://www.pmf.sc.gov.br/turismo).

Um

fator

preocupante

associado

ao

aumento do número de pessoas é o incremento na produção de esgoto doméstico aliado a necessidade de estrutura adequada para a coleta, tratamento e lançamento desses efluentes. O lançamento de esgoto doméstico em águas superficiais é a principal causa de poluição dos ecossistemas marinhos e estuarinos ao redor do mundo (Walker et al., 2001). Dentro desse contexto, as cidades brasileiras carecem de sistemas apropriados para lidar com seus efluentes e os mesmos muitas vezes são lançados sem tratamento diretamente nos ecossistemas (Abessa et al., 2005). Os parâmetros considerados poluentes e que normalmente são monitorados nas estações de tratamento de esgoto são a demanda bioquímica de oxigênio (DBO), sólidos suspensos (SS), nitrogênio total, nitrito, nitrato e amônia, fósforo orgânico e inorgânico e microrganismos patogênicos, mas análises de metais e contaminantes orgânicos diversos podem também estar presentes (Cameron et

7

al., 2003). Já nos ecossistemas a análise normalmente empregada que reflete a qualidade de água é a microbiológica. A resolução nº 357 do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA 357) que dispõe sobre a classificação dos corpos d’água e estabelece condições e padrões para o lançamento de efluentes, define coliformes termotolerantes como: “bactérias gram-negativas, em forma de bacilos, oxidasenegativas, caracterizadas pela atividade da enzima B - galactosidase. Podem crescer em meios contendo agentes tenso-ativos e fermentar a lactose nas temperaturas de 44 – 45 ºC, com produção de ácido, gás e aldeído. Além de estarem presentes em fezes humanas e de animais homeotérmicos, ocorrem em solos, plantas ou outras matrizes ambientais que não tenham sido contaminados por material fecal”. Conforme afirma a própria resolução, a presença de coliformes não é exclusiva de matéria fecal, sendo que os mesmos já foram detectados em amostras de solo, madeira e cascas de madeira de indústria de papel e celulose em setores que não tem contato com esgoto (Gauthier e Archibald, 2001). A comparação dos dados de contaminação por coliformes com freqüência é dificultada pelo fato dos pesquisadores utilizarem métodos diferentes (Hench et al., 2003; Gauthier & Archibald, 2001). Por outro lado as estações de tratamento normalmente apresentam sucesso na redução do número de coliformes presentes no esgoto, por vezes atingindo 99% de eficiência (Hench et al., 2003). Além do alto teor de matéria orgânica e da presença de patógenos, o esgoto apresenta contaminantes utilizados em grande quantidade no cotidiano, tais como produtos de higiene pessoal e limpeza doméstica, medicamentos humanos e veterinários, surfactantes e resíduos de surfactantes e aditivos industriais. Esses contaminantes não precisam ser persistentes no ecossistema para causar efeitos negativos, visto que são introduzidos continuamente no ambiente (Petrovic et al., 2003). Outro grupo de contaminantes presentes no esgoto são os chamados desreguladores endócrinos. Contaminantes com estrutura química similar a dos hormônios esteróides que interferem principalmente no eixo hipotálamo-hipófise-gônadas causando alterações no desenvolvimento e falência reprodutiva, principalmente em organismos aquáticos (Leusch et al., 2006). Alguns pesticidas, químicos industriais,

8

derivados de plástico e produtos de limpeza doméstica estão entre os compostos que se ligam ao receptor de estrógeno induzindo a síntese de vitelogenina em organismos macho (Tilton et al., 2002). Além desses, o hormônio sintético etinilestradiol é prescrito como contraceptivo oral para milhões de mulheres todos os anos. Sua afinidade pelo receptor de estrógeno é maior do que o hormônio natural 17 – B-estradiol. Uma classe de compostos lipofílicos, e desse modo sujeitos à biomagnificação e que estão associados a uma série de desordens crônicas, principalmente reprodutivas, são as bifenilas policloradas (BPCs) (Canesi et al., 2003). BPCs são compostos que apresentam alta estabilidade química e térmica, miscibilidade com compostos orgânicos, alta constante dielétrica e baixo custo. Estas propriedades fizeram com que tivessem uma ampla aplicação comercial sendo utilizados como fluidos dielétricos de transformadores e capacitores, fluidos hidráulicos, lubrificantes, plásticos, retentores de calor e chama, além de transformá-lo em um dos principais contaminantes dos oceanos e estuários nos últimos 50 anos (Kenish, 1997). A produção de BPCs nos Estados Unidos iniciou em 1929 e foi interrompida em 1977 e no Brasil está proibida desde 1981, pela portaria interministerial n0 19 de 29/01/81, entretanto a utilização de equipamentos que contenham BPC está autorizada até sua substituição por outro livre do composto. A composição do esgoto pode incluir ainda outros compostos clorados como os inseticidas dicloro-difenil-tricloroetanos (DDTs), compostos derivados de óleos e graxas como os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) e derivados de detergentes como os alquilbenzenos lineares (ABLs). Os ABLs são utilizados na formulação de detergentes por apresentarem baixo teor de subprodutos insolúveis e maior rendimento, aumentando a solubilidade do tensoativo e melhorando seu poder de detergência. A estrutura é um dos fatores que afetam a biodegradação do composto e a relação entre os isômeros internos e externos dos ABLs fornece informações sobre o tempo de existência do efluente. Os isômeros externos são aqueles em que o grupo fenila está mais próximo do átomo de carbono terminal da cadeia alquílica e os isômeros internos são aqueles em que o grupo fenila está mais distante. (Penteado et al., 2006). Com o aumento populacional e a escassez de água potável são cada vez mais comuns as iniciativas para armazenar e reutilizar

9

água. A captação de água para abastecimento da população por vezes ocorre em locais onde à montante existe um lançamento de esgoto tratado. Stackelberg

e

colaboradores

(2004)

detectaram

a

presença

de

40

contaminantes orgânicos como tetrahidronaftaleno (fragrância), bisfenol A (fungicida, anti-chama), cafeína (estimulante), carbamazepina (anticonvulsivo) e cotinina (metabólito da nicotina) em reservatório de água potável reutilizada. O tratamento primário de efluentes tem por finalidade remover sólidos em suspensão e compostos que aumentem as demandas química e bioquímica de oxigênio.

O tratamento avançado tem por finalidade remover constituintes

inorgânicos dissolvidos tais como fosfato. Dessa forma as estações de tratamento de esgoto doméstico não são concebidas com a finalidade de eliminar contaminantes orgânicos que normalmente estão presentes em níveis traço, sendo comum a presença desses elementos no esgoto mesmo após o tratamento. Florianópolis conta atualmente com cinco estações de tratamento de esgoto em funcionamento, duas em implantação e outra planejada. Atualmente os cultivos de moluscos ocupam cerca de 25% da área disponível para aquicultura. A possibilidade de incremento das duas atividades deve ser trabalhada com planejamento para que um possível conflito seja evitado. Nesse sentido o desenvolvimento de ferramentas de análise sensíveis e capazes de contribuir com programas de fiscalização e gerenciamento da qualidade dos organismos se faz necessário. O objetivo deste trabalho é identificar genes que possam ser utilizados como biomarcadores de contaminação por esgoto doméstico em programas de monitoramento e gerenciamento ambiental.

10

2

Objetivos

2.1

Geral

Identificar genes diferencialmente expressos em ostras Crassostrea gigas expostas a esgoto doméstico não tratado, que possam servir como biomarcadores de contaminação em programas de gerenciamento ambiental.

2.2

Específicos

- identificar, clonar e sequenciar genes que tenham a expressão induzida quando as ostras são expostas a esgoto doméstico não tratado;

- depositar as seqüências dos fragmentos gênicos identificados no banco mundial de genes (Genebank);

- desenhar iniciadores de DNA para alguns dos genes identificados e avaliar a expressão dos genes individualmente, em ostras expostas a esgoto não tratado em aquários;

- verificar a aplicabilidade dos genes identificados como biomarcadores através de experimento in situ de exposição das ostras a locais contaminados por esgoto doméstico.

11

3 3.1

Material e Métodos Ostra Crassostrea gigas Reino Animalia Filo Mollusca Classe Bivalvia Ordem Ostreoida Família Ostreidae Espécie Crassostrea gigas

A ostra Crassostrea gigas (Thunberg, 1793) apresenta concha sólida, extremamente enrugada e laminada. A forma da concha varia muito com o ambiente e a cor é geralmente esbranquiçada por fora e branca por dentro. Apresenta um único músculo adutor que pode ser escuro, mas nunca púrpura ou preto, característica que a difere da espécie Crassostrea virginica. Apresenta fase larval planctônica que se desloca pela coluna d´água à procura do substrato ideal para fixação. Prefere substratos firmes e usualmente se fixa sobre rochas ou conchas de outras ostras em profundidades que variam de 5 a 40m. É uma espécie cosmopolita tendo ocorrência registrada no Japão, Koréia, Sibéria, Estados Unidos, Canadá e Austrália. Atualmente foi introduzida em outros países e é uma das espécies mais cultivadas no mundo. 3.2

Exposição ao esgoto doméstico

3.2.1 Coleta e aclimatação das ostras Ostras adultas (7,6 – 12,9 cm) foram coletadas no cultivo do Laboratório de Moluscos Marinhos (LMM) da UFSC, localizado na praia de Sambaqui, e transportadas em caixas plásticas sem água para a unidade do LMM da Barra da Lagoa. Os animais foram acondicionados dentro do laboratório em dois aquários plásticos de 45 L contendo água marinha filtrada (UV) com salinidade 25 psu, temperatura ambiente e aeração constante por 10 dias. Em um primeiro momento foram colocadas 10 ostras em cada aquário para garantir um número suficiente de animais de um único sexo. Apenas os organismos macho foram utilizados para evitar diferenças na expressão gênica relacionadas ao

12

sexo. Durante esse período as ostras foram alimentadas uma vez ao dia com 12 x 104 céls/mL de microalgas (Chaetoceros militrans e Skeletonema sp) e a água foi trocada diariamente. 3.2.2 Coleta do esgoto O esgoto não tratado foi coletado na Estação Insular de Tratamento de Efluentes da Companhia Catarinense de Águas e Saneamento (CASAN), no centro de Florianópolis (Figura 1). As coletas ocorreram sempre no meio da manhã e o esgoto foi coletado na calha Parshall logo após a remoção dos sólidos por gradeamento, ao chegar na estação. Após a coleta o material foi transportado para o LMM em container de plástico escuro (50 L) e permaneceu em uma sala com ar condicionado durante as 48 horas de exposição. A data das coletas foi agendada para coincidir com as coletas regulares realizadas pelos técnicos da CASAN para análise dos parâmetros físicos químicos e microbiológicos do esgoto afluente.

13

A

B

Figura 1: A – Coleta do esgoto doméstico não tratado pelos técnicos em saneamento da Companhia Catarinense de Água e Saneamento (CASAN); B – Vista parcial da Estação de Tratamento de Esgoto Insular da CASAN, Florianópolis, SC.

3.2.3 Exposição nos aquários Após o período de aclimatação um dos aquários recebeu 33% de esgoto não tratado enquanto o outro aquário recebeu apenas água marinha diluída com água doce na mesma proporção do esgoto, para manter a salinidade constante em 25 psu (Figura 2). A solução de esgoto e a água marinha foram trocadas diariamente durante a exposição. Durante esse período, as ostras foram observadas por inspeção visual para verificar se estavam abrindo as valvas para respiração e/ou alimentação.

14

Figura 2: Exposição das ostras Crassostra gigas a 33% de esgoto doméstico não tratado por 48 h em aquários de 45 L (n=10).

3.2.4 Exposição a locais contaminados por esgoto doméstico Para expor as ostras Crassostrea gigas ao local contaminado por esgoto doméstico in situ foi desenvolvida uma estrutura flutuante de PVC (Figura 3 A, D e E). Foram colocadas 20 ostras por estrutura, acondicionadas na parte central confeccionada com tela de nylon. A estrutura continha também uma placa indicativa com os dados de identificação do experimento, projeto e contato dos pesquisadores (Figura 3B). As estruturas foram colocadas nos pontos de amostragem com auxílio de poitas de concreto e cabos de nylon.

15

A

B

C

D

E

F

Figura 3: A – Estrutura flutuante de PVC para exposição das ostras aos locais contaminados; B – Placa de identificação com os dados do experimento; C – Montagem da estrutura com as ostras; D – Estrutura flutuando em um dos pontos amostrais; E – Recuperação da estrutura tura com as ostras no ponto poluído; F – Malha plástica com as ostras com destaque para uma alça plástica de aromatizante de vaso sanitário.

Foram definidos 4 locais de exposição afastando-se da foz do Rio Bücheller adentrando na a Baía Norte da Ilha de Santa Santa Catarina, SC (Figura 4). Os locais 1, 2, 3 e 4 estão distantes 15, 400, 1500 e 4500 m respectivamente da foz do Rio Bücheller. A escolha destes locais se baseou em um estudo anterior realizado devido a uma parceria entre a Escola do Mar do município de São José, SC, e o Centro Federal de Educação Tecnológica (CEFET-SC) (CEFET que realizou análises periódicas no local (Projeto Baía Limpa - monitoramento de parâmetros físicos, químicos e microbiológicos). Este estudo confirmou a

16

existência de um gradiente de contaminação por coliformes totais e fecais entre estes locais. Nesse trabalho as ostras permaneceram nos locais amostrais por 14 dias (31/08 – 14/09/2006). Ao final do experimento as estruturas foram recuperadas e transferidas para o laboratório para preparo da amostra. Enquanto permaneceram no laboratório os animais ficaram em aquários com água marinha de cada local de exposição. Para analisar a presença de contaminantes orgânicos nas ostras e no sedimento foram congeladas 3 ostras a -20 ºC e foi coletada uma amostra de sedimento por ponto amostral com pegador tipo “van Veen”. No início, durante e ao final da exposição foram analisados os parâmetros físico e químicos (temperatura, oxigênio dissolvido, pH, salinidade e turbidez) da água marinha dos locais de exposição e foram coletadas amostras de água para análise de DBO5, NH4, NO2, PO3 e coliformes fecais. A coleta e a análise das amostras de água obtida nos locais de exposição foram realizadas

segundo

técnicas

do

STANDARD

METHODS

FOR

THE

EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER APHA-AWWA-WPCF, 20a edição.

17

Figura 4: Vista parcial da Baía Norte da ilha de Santa Catarina. SJ1 – Local 1 (Foz do Rio Bücheller); SJ2 – Local 2; SJ3 – Local 3 (cultivo de moluscos); SJ4 – Local 4 (Pedra das Tipitingas – local referência); Trapiche – Escola do Mar, São José, SC.

3.3

Análises Químicas A análise dos contaminantes orgânicos presentes nas ostras (n=10 por

local amostral) e no sedimento dos locais de exposição do experimento in situ foram realizadas em colaboração com o Laboratório de Química Orgânica Marinha do Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo (IO-USP). Os tecidos congelados da Crassostrea gigas foram secos durante 72 horas em liofilizador Thermo Savant – modulyo D. Em seguida, as amostras foram maceradas e homogeneizadas em almofariz com pistilo e armazenadas em frascos de vidro previamente limpos com solvente. O procedimento metodológico descrito a seguir foi baseado em MacLeod e colaboradores (1986) com algumas modificações. Um grama de cada uma das amostras foi extraído com n-hexano e diclorometano 50% (v/v) em soxhlet durante 8 horas. Foram utilizados solventes com grau de pureza “para análise de resíduos orgânicos” (J. T. Baker, Estados Unidos). Antes da extração foram

18

adicionados 100 µL dos padrões internos (surrogate) com diferentes concentrações no branco e em cada uma das amostras. Para os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) foram adicionados naftaleno-d8, acenafteno-d10, fenantreno-d10, criseno-d12 e perileno-d12 (5 ng µL-1); para os bifenilos policlorados (BPCs) e pesticidas organoclorados foram utilizados o PCB-103 e PCB-198 (1 ng µL-1); o padrão interno dos alquilbenzeno lineares (ABLs) foi o dodecil alquilbenzeno (1C12LAB, 5 ng µL-1). O extrato evaporado foi submetido a uma coluna cromatográfica contendo 8 gramas de sílica gel sobre 16 gramas de alumina (ambas da Merck) 5% desativadas com água pré-extraída e 1 grama de sulfato de sódio da J. T. Baker no topo. A eluição foi feita com 80 mL de uma mistura de n-hexano e diclorometano (50%). Para purificação complementar, o eluato foi concentrado a 0,5 mL e injetado no cromatógrafo a líquido de alto desempenho (HPLC) da Perkin Elmer equipado com duas colunas de exclusão (permeação em gel). A fase móvel utilizada foi o diclorometano. O eluato foi concentrado novamente e foram adicionados os padrões internos cromatográficos (octacloronaftaleno para HPAs, TCMX para BPCs e pesticidas e 1C19LAB para os ABLs). O volume final foi de 1 mL. Uma alíquota do extrato final foi injetada no cromatógrafo a gás equipado com detector de captura de elétrons (GC-ECD) da Agilent Technologies para análise de pesticidas organoclorados. Os demais grupos de compostos (HPAs, BPCs e ABLs) foram analisados no cromatógrafo a gás equipado com espectrômetro de massas (GC-MS) 6890/5973N da Agilent Technologies. As temperaturas do injetor e detector do GC-ECD foram de 280 oC e 300 o

C, respectivamente. O gás de arraste foi o hidrogênio ultrapuro e o gás auxiliar

foi o nitrogênio. A coluna cromatográfica era de 30 metros de comprimento, diâmetro interno de 0,25 mm e espessura do filme de 5% fenilmetilsiloxana de 0,5 µm da marca J&W Scientific. A rampa de temperatura utilizada foi: início a 70 oC por 1 minuto, aumento a uma taxa de 40 oC até 170 oC e a 1,5 oC até 240

o

C, permanecendo nesta temperatura por 2 minutos, e aumentando

novamente a 15 oC até 300 oC permanecendo isotérmico por 5 minutos. As temperaturas do GC-MS foram de 280 oC, 280 oC e 300 oC no injetor, na interface e na fonte de íons, respectivamente. A coluna cromatográfica

19

utilizada foi da J&W Scientific com 30 metros de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm de espessura de filme de 5% fenilmetilsiloxana. O modo de aquisição foi o SIM (monitoramento seletivo de íons). A rampa de temperatura para BPCs foi: início a 75 oC durante 3 minutos, aumento a uma taxa de 15 oC até 150 oC e a 2 oC até 260 oC e a 20 oC até 300 oC permanecendo constante durante 1 minuto. A rampa para os HPAs e ABLs teve início em 40 oC com aumento a taxa de 20 oC até 60 oC e a 5oC min-1 até 290 oC onde permaneceu por 5 minutos e aumento a 10 oC até 300 oC onde permaneceu constante durante 10 minutos. A identificação dos pesticidas, HPAs, BPCs e ABLs foi feita por comparação dos tempos de retenção com padrões de referência da Accustandard, EUA. Os compostos analisados no GC-MS também foram identificados também através do espectro de massa. A quantificação foi feita por razões entre os surrogates e os compostos de interesse, baseada nas curvas analíticas montadas com pelo menos 05 concentrações diferentes de cada grupo de compostos.

3.4

Análises Moleculares

3.4.1 Preparo da amostra Após as exposições foi realizada a biometria das ostras e estas foram mortas por rompimento do músculo adutor (Figura 5). A biometria permite calcular o Índice de Condição (I.C.), obtido pela razão entre o peso da carne e o peso da concha multiplicado por 100 ((PCarne/PConcha)*100)(Domingos et al, 2007). As brânquias foram dissecadas e armazenadas em solução para preservação do RNA (RNAlater – Ambion) e o sexo foi identificado por microscopia das gônadas. Apenas os animais machos foram utilizados nos experimentos. Além das brânquias, a glândula digestiva também foi dissecada no experimento in situ.

20

GD G M B

Figura 5: Ostra Crassostrea gigas com destaque para glândula digestiva (GD); gônadas (G); músculo adutor (M) e brânquias (B).

3.4.2 Identificação dos genes diferencialmente expressos 3.4.2.1 Extração RNA total As brânquias das ostras foram lavadas duas vezes com 1 mL de tampão TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA pH 8,0) seguido de centrifugação a 2000 g por 2 minutos a 4 ºC, para remoção do muco e fitoplâncton. Esse procedimento não foi realizado com as amostras de glândula digestiva. A extração do RNA total das brânquias e glândula digestiva foi realizada em homogeneizador do tipo Potter com um reagente comercial a base de etanol e tiocianato de guanidina (TRIzol - Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante com poucas modificações (proporção 200 mg tecido / 1 mL de Trizol; 30 minutos de incubação após a homogeneização). Nessa primeira etapa foi extraído RNA total de uma amostra do grupo controle (pool 3 animais; 1 g de tecido) e uma amostra do grupo exposto (pool 3 animais; 1 g de tecido). Ao final da extração as amostras foram ressuspendidas em 100 µL de água para biologia molecular. Após a extração, a concentração e a pureza do RNA foram checadas em espectrofotômetro a 260 nm e pela razão da absorbância 260/280 nm, respectivamente. A integridade do RNA foi analisada por eletroforese em gel de agarose 1% formaldeído 5% em tampão MOPS 1x corado com brometo de etídio e observado sob luz ultravioleta.

21

3.4.2.2 Purificação do RNA mensageiro O RNAmensageiro foi isolado com o kit comercial Oligotex mRNA Midi kit (Qiagen). Esse kit utiliza contas de látex contendo oligonucleotídeos de timina (oligo-dT) que hibridizam com a cauda poli-A dos RNA mensageiros presentes na amostra, sendo que os demais tipos de RNA não são capturados. O procedimento foi realizado com 1mg de RNA total dos grupos controle e exposto (foi necessário juntar amostras de 2 extrações de RNA total de cada grupo para obter a quantidade necessária), totalmente de acordo com as instruções do fabricante do kit. O RNAm foi concentrado com a adição de 0,1 vol. de NaAc pH 5,2 e 2,5 vol. de isopropanol, incubado a -20 oC por 1 h. Após a incubação a amostra foi centrifugada a 14.000 g / 20 min / 4 oC e lavada 2 vezes com etanol 80%. O pellet foi ressuspendido em água. Para obter a quantidade de RNAm necessária para a hibridização subtrativa foram reunidas amostras de duas extrações de cada grupo. A concentração e pureza do RNAm foram avaliadas conforme descrito acima. 3.4.2.3 Hibridização subtrativa supressiva A partir de 2 µg de RNAm das brânquias das ostras dos grupos controle e exposto ao esgoto foi realizada a hibridização subtrativa após a síntese do cDNA, com o kit PCR Select cDNA Subtraction Kit (Clontech). Este kit permite a hibridização dos fragmentos de cDNA comuns aos dois grupos (controle e exposto), enquanto os fragmentos diferencialmente expressos são amplificados por reações de PCR ao final do procedimento. O processo da hibridização subtrativa começou com a síntese de cDNA a partir de mRNA, e subseqüente digestão desse material pela enzima de restrição Hae III. Uma das populações de cDNA, denominada de tester e cujos genes diferencialmente expressos foram amplificados, foi dividida em dois grupos e a cada um desses grupos foi ligado um oligonucleotídeo adaptador específico na extremidade 5’ (Figura 1). Após a ligação dos adaptadores, adicionou-se a cada uma das porções de tester determinada quantidade do outro grupo de fragmentos, denominada de driver, para que ocorresse a hibridização dos fragmentos comuns aos dois grupos (desnaturação 98 ºC / 90s; hibridização 8 h / 68 ºC). A seguir realizou-se uma segunda hibridização, unindo as duas porções do tester e adicionando-se novamente o driver (20 h /

22

68 ºC), porém sem prévia desnaturação. Essa hibridização originou moléculas contendo os dois adaptadores diferentes (hibridização dos tester entre si), que representam os genes diferencialmente expressos (presentes apenas na amostra tester) e que foram então amplificados pelo PCR supressivo. As amostras dos animais expostos ao esgoto compuseram o grupo tester, de modo que foram analisados os genes diferencialmente expressos nesse grupo (genes cuja expressão foi induzida após a exposição ao esgoto). Para realização da reação de PCR supressivo as extremidades complementares aos adaptadores foram preenchidas através da incubação da reação a 75 ºC por 5 minutos, criando pontos de ancoragem para os iniciadores

de

DNA.

Nessa

reação

as

moléculas

com

sequências

complementares nas duas extremidades apresentam forte tendência a hibridizar consigo mesmas formando uma alça, ao invés de anelar com os iniciadores da reação. Quando ocasionalmente um iniciador consegue anelar e é estendido, a molécula formada também contém sequências complementares nas extremidades e é suprimida. Assim somente os cDNAs com diferentes adaptadores nas duas extremidades foram amplificados exponencialmente nessa reação. A segunda reação, denominada nested PCR, foi realizada para reduzir ainda mais o background, enriquecendo os transcritos diferencialmente expressos e fazendo com que transcritos diferentes que variavam em abundância na amostra original de RNAm apresentem-se em proporções aproximadamente iguais.

23

Tester – Adp 1

Driver

Tester – Adp 2

1ª Hibridização (mistura o grupo driver com cada um dos grupos tester em separado).

Genes comuns aos dois grupos.

Genes presentes apenas no grupo exposto.

2ª Hibridização (mistura ( os 2 grupos tester e adiciona mais do grupo driver).

Adição de primers e amplificação por PCR.

Ausência de amplificação das moléculas com adaptadores iguais.

Figura 6: Esquema ilustrativo da hibridização subtrativa supressiva TM (adaptado de Clontech PCR-Select PCR cDNA Subtraction Kit User Manual).

24

3.4.2.4

Clonagem dos fragmentos de cDNA diferencialmente

expressos Os produtos de PCR diferencialmente expressos foram purificados pelo kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) e ligados em vetores

pGEM-T

Easy

(Promega)

para

transformação

das

células

competentes JM-109, através de choque térmico. Estas células são recomendadas pelo fabricante por serem compatíveis com o sistema de identificação colorimétrica de eficiência da transformação. Após a transformação, 200 µl da solução contento as bactérias transformadas foram aplicados em placa contendo ágar 35 g/L (LB AgarSigma), ampicilina (100 mM), IPTG 0,5 mM e X-Gal 50 mM e deixadas a 37 ºC por 18 horas para crescimento de colônias. Ao final do procedimento, as colônias de bactérias que possuíam o plasmídeo com o inserto apresentaram cor branca. Todas as colônias brancas foram transferidas separadamente para tubos de ensaio contendo meio de cultura líquido 20 g/L (LB Broth - Sigma) durante 18 horas a 37 ºC em agitação constante para amplificação da concentração de cDNA.

3.4.2.5 Purificação do plasmídeo A purificação do plasmídeo foi feita a partir de 3 mL do meio líquido contendo a colônia utilizando o kit Perfectprep Plasmid Mini (Eppendorf) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração do material purificado foi checada em espectrofotômetro a 280 nm e a inserção do plasmídeo foi conferida através de eletroforese em gel de agarose 1,2% após a digestão do plasmídeo pela enzima ECO RI.

3.4.2.6 Sequenciamento Os fragmentos de cDNA diferencialmente expressos e purificados foram encaminhados

para

sequenciamento

no

Laboratório

de

Hanseníase

(FIOCRUZ) em colaboração com o Dr. Milton Ozório de Moraes. Para o sequenciamento foi utilizado um sequenciador ABI3730 de 48 capilares (Applied Biosystems). O seqüenciamento foi realizado com o kit ABI Prism Big

25

Dye Terminator Cycle Sequencing kit (PE Applied Biosystems). A manipulação das seqüências foi realizada com o programa para Edição de Seqüências Bioedit (Hall, 1999).

3.4.2.7 Análise das seqüências As seqüências obtidas foram comparadas com o banco de dados disponíveis no banco de genes. A análise dos dados foi realizada com o programa tBLASTn (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

3.4.3 Análise dos genes diferencialmente expressos na exposição ao esgoto em aquários 3.4.3.1 Extração RNA total das brânquias de ostras O RNA total das brânquias de 5 ostras macho dos grupos controle e exposto foram extraídos individualmente, conforme descrito acima e tiveram sua pureza e integridade verificadas em espectrofotômetro (3.4.2.1). 3.4.3.2 Síntese de cDNA das brânquias de ostras A síntese do cDNA foi realizada com o kit OmniscriptTM Reverse Transcriptase (Qiagen) a partir de 2 µg de RNA total acrescido de dNTP 5 mM; oligo-(dT)15 (Promega) 1 µM; inibidor de RNase 10U, transcriptase reversa omniscript 4U. As amostras foram incubadas por 60 minutos a 37

o

C e

posteriormente armazenadas a -20 oC. A concentração e a pureza do cDNA foram checadas em espectrofotômetro a 260 nm e pela razão da absorbância 260/280 nm, respectivamente. 3.4.3.3 Desenho dos iniciadores de DNA Para confirmação da indução da expressão gênica nas ostras expostas ao esgoto foram desenhados iniciadores de DNA com o software Primer3 (Rozen & Skaletsky, 2000) para 5 dos genes identificados (Tabela I). Esses genes estão envolvidos em mecanismos de biotransformação de fases I, II e III (Citocromo P450 - CYP 356A1; Glutationa S-transferase classe ômega - GSTO e proteína de resistência a múltiplas drogas - MDR), ligação e transporte de ácidos graxos e compostos hidrofóbicos (FABP) e síntese do grupo heme

26

(ALAS). Além desses desenhou-se iniciadores também para o gene constitutivo gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH).

27

Tabela 1: Pares de iniciadores e tamanho esperado dos fragmentos gênicos analisados nas brânquias de Crassostrea gigas expostas a esgoto doméstico não tratado. Gene

CYP356A1

GSTO

MDR

FABP

ALAS

GAPDH

Iniciadores sense: 5´CCA GAA GAA TTT GAC CCA CTT CG 3´ antisense: 5´TTT GTA ATC GGA CGG AAG CTC TAC 3´

sense: 5´GGT GTA TCC CGA TAA CAA GCT GAC 3´ antisense: 5´CTG AGG GTC CAG TCG ACA TTT TT 3´

sense: 5´GGC AGT CAT GTT CTT TGC CTA TG 3´ antisense: 5´GCA GCC ATT GGA CAT TTA GAT CCT 3´

sense: 5´ GTT TGA GGG AAA CTG GGA ATG C 3´ antisense: 5´ TCC GTC GGA ATA TGT CAG TTT AGC 3´

sense: 5´AGA CCT CAC ACT CAT CCG GAC AGA CAG 3´ antisense: 5´ CTT CAC TAC CAG TCT CCT CCC ACC AC 3´

sense: 5´ ACT CCA AAG ACC AGA ACA TCG T 3´ antisense: 5´CAA AGC TGT CGG AAA GGT TAT C 3´

Expected size (bp) 249

362

443

255

427

275

3.4.3.4 Padronização das condições de PCR As reações de amplificação foram realizadas utilizando-se o kit de PCR da empresa Biosystems (Biosystems Comercial, Importadora, Exportadora de Equipamentos de Laboratório Ltda) e continham Tampão PCR 1x, Taq Biossystems (1U), dNTPmix (10 mM cada dNTP), MgCl2 (2 mM), iniciadores sense e antisense (10 µM) e 1,2 µg de cDNA. Os pares de iniciadores utilizados nas reações de PCR foram testados em ensaio preliminar para otimizar as condições de amplificação do cDNA e estabelecer o número de ciclos ideais para cada reação, visando analisar a expressão de cDNA em sua fase exponencial de amplificação. Definido o número de ciclos para cada gene, foi realizado um PCR semiquantitativo com o cDNA das brânquias de ostras macho dos grupos controle e exposto (n=5).

28

Ao iniciar as análises moleculares das amostras de ostras expostas a esgoto no ambiente, o kit de PCR foi substituído pelo da empresa Biotools (Biotechnological & Medical Laboratories-SA, Espanha). As condições da reação de PCR foram mantidas, entretanto foi realizada nova padronização do número de ciclos para cada gene analisado. 3.4.3.5 Análise da expressão gênica por RT-PCR semi-quantitativo As reações de RT-PCR foram realizadas em um termociclador TGradient (Biometra) conforme descrito na Tabela 2.

Tabela 2: condições das reações de RT-PCR para análise da expressão gênica em brânquias de Crassostrea gigas expostas a esgoto doméstico não tratado. Gene

PCR

CYP356A1

2 min. 94oC; 25 ciclos de 94oC por 15s, 51oC por 45s e 72oC por 60s.

GSTO

20 ciclos de 94oC por 30s, 52oC por 45s e 72oC por 60s.

MDR

2 min. 94oC; 32 ciclos de 94oC por 30s, 52oC por 45s e 72oC por 60s.

FABP

2 min. 94oC; 5 ciclos de 94oC por 15s diminuíndo 2oC da temperatura de anelamento por ciclo, iniciando em 60oC, 72oC por 30s; 18 ciclos de 94oC por 15s, 51oC por 45s e 72oC por 30s.

ALAS

26 ciclos de 94oC por 30s, 58oC por 30s e 72oC por 30s.

GAPDH

2 min. 94oC; 27 ciclos de 94oC por 15s, 49oC por 45s e 72oC por 60s.

29

3.4.3.6 Eletroforese em gel de agarose Os produtos das reações de PCR foram analisados em gel de agarose 1,2%/TAE 1X, corado com brometo de etídeo (0,7 µg/ml). Foram aplicados 10 µl de cada amostra com o tampão 6X azul/laranja (Promega). Após a eletroforese o gel foi visualizado e fotografado em luz U/V para realizar a densitometria. 3.4.3.7 Densitometria A intensidade das bandas com o material amplificado dos genes CYP356A1, GSTO, MDR, ALAS e FABP foi analisada por densitometria com o software GelQuant. Para normalização da expressão dos genes supracitados foi utilizada a expressão do gene GAPDH, que não apresentou variação entre os grupos.

3.4.4 Análise dos genes diferencialmente expressos na exposição ao esgoto no ambiente Cinco ostras macho mantidas por 14 dias em cada local de exposição (Figura 4) foram separadas para extração do RNA total e síntese do cDNA conforme descrito nos itens 3.4.2.1 e 3.4.3.2. A expressão dos genes CYP356A1, GST, MDR, FABP e ALAS foi analisada por PCR semi-quantitativo com iniciadores específicos nas mesmas condições descritas no item 3.4.3.5, entretanto o gene normalizador utilizado foi o da Actina (ACT: 94 ºC por 2 min.; 25 ciclos de 94 ºC / 15s, 61 ºC / 45s e 72 ºC / 30s). O produto da reação de PCR foi analisado em eletroforese em gel de agarose e submetido à densitometria conforme já descrito (3.4.3.6 e 3.4.3.7).

3.4.5 Análise Estatística dos dados Os dados obtidos pela densitometria dos fragmentos amplificados nos experimentos de RT-PCR semiquantitativo da exposição em aquários foram comparados estatisticamente pelo teste t de Student utilizando-se um p6,00mg/L

2.5

30.0 27.5

0.0

25.0 31/08

06/09

14/09

31/08

Temperatura

o

Temperatura ( C)

14/09

8.5

Lc 1 Lc 2 Lc 3 Lc 4

21 20 19

8.0

Lc Lc Lc Lc

1 2 3 4

Lc Lc Lc Lc

1 2 3 4

18 7.5

17 16 15

7.0 31/08

06/09

14/09

31/08

14/09

1 2 3 4

0.020 -1

0.75

0.025

0.015

mg.L

Lc Lc Lc Lc

1.00

0.50

06/09

NO2

N-NH4 1.25

mg.L-1

06/09

pH

22

CONAMA357 1; índice III) a área é considerada poluída. O local 1 apresentou quase o dobro de coprostanol em relação a colesterol (1,83), sendo considerado contaminado por esgoto doméstico também pelos índices I e II. Com base nos dados de sedimento, o local 2 pode ser considerado poluído apenas pelo índice II, pois apresentou a maior concentração de colesterol, enquanto os locais 3 e 4 não podem ser classificados como poluídos pois não apresentaram coprostanol e colestanol em quantidades detectáveis, embora tenham sido encontrados níveis significativos de coliformes fecais nesses locais (Figura 8). Os alquil-benzenos lineares (ABLs) ocorrem como componentes traços na formulação de detergentes e são introduzidos no esgoto a partir do uso de detergentes domésticos e industriais (Eganhouse & Sherblom, 2001). Devido à hidrofobicidade desses compostos, normalmente estão associados à matéria orgânica particulada e consequentemente podem ser encontrados no sedimento. Eganhouse e Sherblom (2001) encontraram ABLs associados à matéria orgânica particulada em áreas com sobrefluxo de estações de tratamento de esgoto. No sudoeste da Espanha foram detectados entre 293 e 1938 ng/g ps de ABLs totais no sedimento (Lara-Martin et al., 2008) enquanto

53

na Baía de Tóquio as concentrações observadas foram entre 1000 e 3000 ng/g ps (Takada et al., 1992). Na Baía norte da Ilha de Santa Catarina os valores são menores do que os citados acima, entretanto existe um gradiente de contaminação de ABLs no sedimento sendo que o local contaminado apresenta o dobro da concentração do local referência (Tabela 4). A detecção dessa classe de contaminantes por si só caracteriza a presença de esgoto doméstico na região e a presença de ABLs no sedimento corrobora os dados de coliformes e esteróides, além dos parâmetros físicos e químicos (Figura 8; Tabela 4). A relação entre os isômeros internos e externos (I/E) dos ABLs reflete o tempo de existência do esgoto, pois os isômeros externos são degradados mais rapidamente que os isômeros internos, de modo que o índice aumenta com a biodegradação da contaminação. De acordo com a literatura valores menores ou iguais a um (

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Author: Roderick King

Last Updated: 02/04/2023

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